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高效毛細管電泳色譜儀在DNA測序中的應用 
(發布日期:2017-5-9 9:04:02) 來源:
 
   
高效毛細管電泳色譜儀簡稱毛細管電泳儀(CE),是以毛細管為分離通道,以高壓直流電場為驅動力,利用荷電粒子之間的淌度差異和分配系數差異進行分離,是分析科學繼高效液相色譜儀之后的又一重大進展,使分析科學從微升級進入到了納升級水平,不僅使單細胞乃至單分子分析成為可能,也使蛋白質和核酸等生物大分子分析有了新的轉機。
人類基因組計劃對人類基因組DNA全序列測定隨著電泳從平板凝膠電泳、毛細管凝膠電泳、線性高分子溶液毛細管電泳、毛細管陣列電泳,到全基因組測序技術的發展,已于2001年宣布提前完成,被公認為是分析化學家拯救了人類基因組計劃。對其它生物的DNA測序仍在繼續,方向主要是提高測序速度、準確度和大分子片段的認讀長度。人類基因組計劃提前完成的關鍵是DNA測序方法的改進,而CE就是一種比較適合快速、靈敏、準確、廉價和自動化等要求的方法之一。
一、毛細管凝膠電泳(CGE):
CGE是將平板凝膠電泳的凝膠移到毛細管中作支持介質的電泳,可按照分子大小進行分離。常用支持介質有聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖凝膠等。1990年,首次用CGE進行DNA序列測定的嘗試,并初步獲得成功,隨后凝膠的制備和新分離模式迅速發展。CGE與LIFD相結合,成為DNA快速序列分析的優選方案之一,并對人類基因組計劃的完成發揮了重要作用。
二、線性高分子溶液毛細管電泳:
雖然CGE是CE中分離度極高的一種模式,但CGE的凝膠柱制備和應用仍然存在問題,如凝膠形成、電泳中氣泡的產生和使用過程中焦耳熱對支持介質的降解使毛細管壽命縮短等。而在低粘度的非交聯線性高分子溶液DNA測序中,高分子溶液可更換,使壽命延長。1993年,首次使用線性聚丙烯酰胺進行DNA測序。隨著技術的不斷改進,線性高分子溶液毛細管電泳采用程序升溫已用于DNA限制性片段快速分離,采用脈沖電場毛細管進行DNA測序,分離的DNA片段可達1000bp。
三、毛細管陣列電泳(CAE):
一般的CE很難做到傳統聚丙烯酰胺凝膠電泳所具備的多通道同時分析,利用共焦激光熒光掃描檢測系統解決了由多根毛細管組成的毛細管陣列同時檢測的問題,這一技術被稱為毛細管陣列電泳(CAE)。CAE無需凝膠,樣品用量少,提高了效率,降低了測序成本,并實現了自動化,加快了速度,但仍有必要進行更高通量的檢測和進一步降低費用。CAE曾成為人類基因組計劃第二個五年計劃(1998~2003年)對DNA測序的三條發展途徑之一。
檢測器一般分為掃描光學檢測器和電荷耦合元件(CCD)陣列檢測器兩類。放射性陣列毛細管微板與掃描器聯用,可實現高通量的DNA檢測,96個樣品采用壓力式毛細管陣列平行進樣,可使96個PBR322限制性內切酶片段在120s內得到高效分離。若同時使用40塊微板,每塊微板上有384個分離通道,則一次進樣量可達15000個,從而達到高通量DNA分析和測序的目的。此外,CE不僅可對DNA的合成片段進行純度檢驗,對PCR擴增的DNA模板進行純化和從反應體系中去除,還可進行文庫建立或復制,啟動子作用方式檢測自然和人工合成RNA的結構。
   
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