等電聚焦電泳色譜儀是利用蛋白質分子或其它兩性分子的等電點不同，在一個穩定的、連續的和線性的pH梯度中進行分離，等電聚焦電泳的關鍵是pH梯度的建立。

一、人工建立pH梯度：

在電場下利用不同pH值緩沖液相互擴散，在混合區間形成pH梯度。此pH梯度易受緩沖液離子的遷移和擴散而變動，重復性差，已不被采用。

二、利用溫度梯度建立pH梯度：

因為溫度可影響緩沖液的解離度，使pH值改變。由于每差別一個pH單位，溫度約差50℃，故這種方法只能建立范圍很窄的pH梯度，而且不易穩定。

三、加入附加物建立pH梯度：

把一些有機溶劑如乙醇和甘油等加到緩沖液中，利用附加物介電常數的變化來改變緩沖液一些組分的解離常數，可建立1.5pH單位的pH梯度。如在硼酸鹽溶液中加0～5%甘油和0～3%蔗糖，可建立pH =7～8.6的梯度，可分離血紅蛋白。

四、利用載體兩性電解質建立pH梯度：

在電極間放入含多種不同等電點電解質的溶液，通電后在電極間形成pH梯度。這些兩性電解質大多是一些多胺基多羧酸化合物。為防止對流對pH梯度的干擾，可采用加入不同濃度的中性或惰性物質形成密度梯度的方法，也可采用在電極間加入凝膠的方法。

五、利用固定化兩性載體建立pH梯度：

把具有緩沖能力的基團或化合物用共聚或接枝的方法固定在載體上形成兩性載體。載體是聚丙烯酞胺凝膠和葡聚糖凝膠等，被固定的化合物是帶羧基的酸和帶叔胺基的堿。采用這種方法可形成穩定的pH梯度，但成本太高。

六、固定化兩性載體和載體兩性電解質相結合：

在固相pH梯度凝膠中加入載體兩性電解質作為添加劑。

七、利用離子交換劑建立pH梯度：

利用離子交換劑建立一個有pH梯度的柱進行等電聚焦。

八、由外循環建立pH梯度：

溶液在兩電極室內進行循環，以在電泳分離室中建立一個穩定的pH梯度。

   

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